DNA抽出法
ここでは動物組織からのキットを用いたDNA抽出法に関して解説します。
現在、様々なDNA抽出キットが販売されていますが、目的にあったキットを選ぶ事が重要です。ここではDNeasy Tissue Kit (Quiagen)とNucleoSpin Tissue (Macherey-Nagel)を用いた標準的な手順を示します。まず標本からDNA抽出に用いるパーツを選定します。保存法は乾燥、液浸いずれでもよいですが、酢酸エチルによる長時間処理や、臭化メチル薫蒸された乾燥標本、低濃度（60％以下）のエタノールで長期間（1年以上）保存された液浸標本ではDNAの収量が極端に落ちます。
そのような標本ではDNA抽出液を用いる抽出法で抽出液による長時間のインキュベーションを行うと効果があります。
DNeasy Tissue Kit
- 1.5mlチューブ（滅菌済み）にATL buffer（キット付属）180µlを入れ、サンプルを加えてぺスチルで押しつぶし、組織を破砕する。破砕後、ボルテックスでよく攪拌する。
Proteinase K 20µl（キット付属）を加え、ボルテックスでよく攪拌し、55℃、1～3時間インキュベート。このとき数度ボルテックスで攪拌するとよい。可能であればローテーター等で回し続けるとよい。条件の悪い標本からの抽出である場合（前述）や、組織片が微量である場合にはこのインキュベーション時間を長く（3時間1昼夜）する。
AL Buffer（キット付属）を200µl加え、ボルテックスでよく攪拌し、70℃、10分間インキュベートし、99.5%エタノールを200µl加えてさらにボルテックスで攪拌する。
- Mini column（白色のカラム）に抽出液をアプライし、≧ 6000 x g、室温で1分遠心。もし溶液がカラムにアプライしきれない場合、このプロセスを溶液がなくなるまで繰り返す。このとき破砕したサンプルをカラム入れないようにするために、軽く遠心してもよい。
- コレクションチューブを交換し、Buffer AW1（キット付属、使用前に99.5%エタノールを添加してあるか確認すること）を500µl加え、≧ 6000 x g、室温で1分遠心。
- コレクションチューブを交換し、Buffer AW2（キット付属、使用前に99.5%エタノールを添加してあるか確認すること）を500µl加え、≧ 20000 x g、室温で3分遠心。
- カラムを1.5mlチューブに移し、Buffer AE（キット付属）100µlを加えて1分置いた後、≧ 6000 x g、室温で1分遠心。
※このプロセスを2回行うことでDNAの収量を増やすことができるが、濃度は低くなる。
NucleoSpin Tissue
- 1.5mlチューブ（滅菌済み）にT1 Buffer（キット付属）180µlを入れ、サンプルを加えてぺスチルで押しつぶし、組織を破砕する。破砕後、ボルテックスでよく攪拌する。
- Proteinase K 25µl（キット付属）を加え、ボルテックスでよく攪拌し、55℃、1～3時間インキュベート。このとき数度ボルテックスで攪拌するとよい。可能であればローテーター等で回し続けるとよい。条件の悪い標本からの抽出である場合（前述）や、組織片が微量である場合にはこのインキュベーション時間を長く（3時間1昼夜）する。
- B3 Buffer（キット付属）を200µl加え、ボルテックスでよく攪拌し、70℃、10分間インキュベートし、99.5%エタノールを210µl加えてさらにボルテックスで攪拌する。
- Tissue columnに抽出液をアプライし、11000 x g、室温で1分遠心。もし溶液がカラムにアプライしきれない場合、このプロセスを溶液がなくなるまで繰り返す。このとき破砕したサンプルをカラム入れないようにするために、軽く遠心してもよい。
- 廃液をすてカラムをコレクションチューブにもどし、Buffer BW（キット付属、使用前に99.5%エタノールを添加してあるか確認すること）を500µl加え、11000 x g、室温で1分遠心。
- 廃液をすてカラムをコレクションチューブにもどし、Buffer B5（キット付属、使用前に99.5%エタノールを添加してあるか確認すること）を600µl加え、11000 x g、室温で1分遠心。
- 廃液をすてカラムをコレクションチューブにもどし、11000 x g、室温で1分遠心し乾燥させる。
- カラムを1.5mlチューブに移し、あらかじめ70℃に暖めたElution Buffer BE（キット付属）100µlを加えて1分置いた後、11000 x g、室温で1分遠心。
※このプロセスを2回行うことでDNAの収量を増やすことができるが、濃度は低くなる。