陸上植物のバーコーディング
植物のバーコーディング
動物のDNAバーコーディングの標準的なバーコード領域としてミトコンドリアのチトクロムC酸化酵素サブユニットI (COI)遺伝子が選択された理由として、動物界の大部分の分類群で利用できるuniversal primerがあり、種レベルでの変異を多く含むことがあげれます。それにたいして植物ではミトコンドリアの種間変異が少なくCOIを種レベルの同定に利用できません。そのため植物では葉緑体ゲノムの領域を使う案が出されていました。このたびConsortium for the Barcode of Life (CBOL) の Plant Working Groupにより，陸上植物の標準的バーコード領域としてrbcLとmatKの利用を推奨する提案がPNASに掲載されました．2009年11月に行われた3rd DNA Barcode of Life Conference で植物の標準的バーコード領域がmatKとrbcLに正式決定されました。参考文献6を参照してください。
<matK>
プライマー配列
| 3F_KIM f | 5′-CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG-3′ |
| 1R_KIM r | 5′-ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC-3′ |
PCR条件(文献７参照)
| 1 cycle | |
| 94°C | 1min |
| 35 cycles | |
| 94°C | 30sec |
| 52°C | 20sec |
| 72°C | 50sec |
| 1 cycle | |
| 72°C | 5min |
<rbcL>
プライマー配列
| rbcLa_F | 5′-ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC-3′ |
| rbcLa_R | 5′-GTAAAATCAAGTCCACCRCG-3′ |
PCR条件(文献７参照)
| 1 cycle | |
| 95°C | 4min |
| 35 cycles | |
| 94°C | 30sec |
| 55°C | 1min |
| 72°C | 1min |
| 1 cycle | |
| 72°C | 10min |
PCR反応液組成(共通)
ExTaq(タカラバイオ)使用時、反応系20µl
| 滅菌水 | 14.8µl |
| 10×ExTaqバッファー(ExTaqに付属) | 2.0µl |
| dNTPs(2.5mmol/lに調整済、ExTaqに付属) | 1.6µl |
| プライマー1(20µmol/lに調整済) | 0.5µl |
| プライマー2(20µmol/lに調整済) | 0.5µl |
| ExTaq | 0.1µl |
| サンプル(10ng/µlに調整済) | 0.1µl |
ここではシーケンスに必要なPCR産物量を20µlとして反応系を設定しています。必要に応じて量を調整してください。
DNA合成酵素はExTaq以外も使用可能ですが、その際には酵素に添付された説明書に従ってプライマー、サンプル以外の組成を調整して下さい。
参考文献
- Lledó MD, Crespo MB, Cameron KM, Fay MF & Chase MW. 1998. Systematics of Plumbaginaceae Based upon Cladistic Analysis of rbcL Sequence Data. Systematic Botany. 23: 21-29.
- Pennisi E. 2007. Wanted: A Barcode for Plants Science. 318: 190-191.
- Sang T, Crawford DJ. & Stuessy TF. 1997. Chloroplast DNA phylogeny, reticulate evolution, and biogeography of Paeonia (Paeoniaceae). American Journal of Botany. 84: 1120-1136. (pdf)
- Tate JA. 2002. Systematics and evolution of Tarasa (Malvaceae): an enigmatic Andean polyploid genus. Ph.D. dissertation. The University of Texas at Austin. (pdf)
- Tate JA. & Simpson BB. 2003. Paraphyly of Tarasa (Malvaceae) and Diverse Origins of the Polyploid Species. Systematic Botany. 28: 723-737.
- CBOL Plant Working Group (2009) A DNA barcode for land plants. Proc Natl Acad Sci USA 106:12794 – 12797.(PDF)
- Reaction conditions used in the CBOL Plant Working Group paper. (PDF)